东波教授论文（GLP1R-GFP稳定转染 Rin-m5F 细胞系的构建）亚健康 56健康网

　　9月6日，首个国家亚健康干预技术成果应用中心落户长沙麓谷,国家中医药管理局亚健康干预技术实验室隶属于国家中医药管理局，是国内唯一从事亚健康干预技术研究的专业机构，拥有以国家973项目主持人、教育部新世纪优秀人才为核心的研究团队，专业从事亚健康干预技术的研究。2012年9月，该实验室主任刘东波教授当选为联合国亚太亚健康干预技术联盟主席，以“未病防病、既病防变、愈后防复”为目标，对慢性非传染性疾病提出心理、行为、膳食和营养干预方案，并于2016年成立了国家中医药管理局亚健康干预技术实验室糖尿病干预中心。糖尿病作为实验室创立后的一个重要的慢性病研究对象，历经长期研究，独创了国内第一套糖尿病中医营养干预技术。

　　刘东波教授文献当中分享了国家中医药管理局亚健康干预技术实验室糖尿病干预中心研究成果。他指出，糖尿病中医营养干预技术就是以三低三高（低血糖负荷、低卡路里、低碳水化合物和高不饱和脂肪酸、高膳食纤维、高药食同源）的饮食模式和间歇性禁食方式治疗糖尿病，以科学的方法为导向，重点教会糖尿病病人正确的健康生活方式，教会他们自我管理血糖的方法，逐步实现恢复胰岛功能，重新夺回控制血糖的主动权，帮助广大糖尿病患者控制病情发展的问题，有利于糖尿病患者科学的自我管理，达到改善健康状况或治疗疾病的目标。

　　胡涌泉 1，2 ，曾璐漫 2，6 ，吴艳阳 2，5 ，魏云林 7 ，刘东波 1，2，3，4*

　　（1. 湖南农业大学园艺园林学院，长沙410128；2. 国家中医药管理局亚健康干预技术实验室，长沙410128；3. 湖南省作物种质创新与资源利用重点实验室，长沙410128；4.湖南省植物功能成分利用协同创新中心，长沙410128；5. 湖南农业大学食品科学技术学院，长沙410128；6. 湖南应用技术学院，湖南常德415100；7. 昆明理工大学生命科学与技术学院，昆明650500）摘要：目的本研究目的是构建一种能稳定表达绿色荧光蛋白（GFP）人胰高血糖素样肽 -1 受体（GLP1R）的胰岛细胞系，用来筛选 GLP1R 激动剂类药物。方法使用 X-tremeGENE HP DNATransfection Reagent将 pCMV6-AC-GLP1R-GFP 质粒转染到 Rin-m5F细胞，经 G418 筛选单克隆 Rin-m5F/GLP1R-GFP 细胞并扩大培养。结果该细胞能稳定传代，荧光显微镜下观察细胞绿色荧光分布均匀，Western blot验证 GLP1R 蛋白表达显著增加。在实验验证中，对照空白组中细胞绿色荧光分布均匀，阴性药物格列本脲（非 GLP1R 靶点药物）作用时细胞内无明显荧光斑点出现，阳性药物百泌达作用（GLP1R 激动剂类药物）时细胞内出现显著荧光斑点。结论GLP1R 激动剂类药物筛选模型 Rin-m5F/GLP1R-GFP 成功构建。该模型能对混合物样品进行筛选，具有假阳性极低、筛选所需样本小、筛选样品量大、易标准化、筛选速度快、特异性强等优势，为 GLP1R 激动剂类药物的筛选奠定了基础。

　　作者简介：胡涌泉，男，在读硕士研究生，主要从事细胞生物学、分子营养研究，E-mail： * 通讯作者：刘东波，男，教授，博士研究生导师，主要从事亚健康干预基础和应用技术研究，Tel：（4，E-mail：86Central South Pharmacy. June 2017, Vol. 15 No.6中南药学 2017 年 6 月第 15 卷第 6 期糖尿病是由遗传因素、病毒感染、自由基毒素、细胞因子等各种致病因子作用于机体导致胰岛功能减退，肝脏、骨骼肌、脂肪组织等发生胰岛素抵抗进而引发的一系列代谢紊乱综合征[1-4] 。临床上以高血糖（空腹血糖＞ 7.0 mmol·L－ 1 ，餐后血糖＞ 11.1mmol·L－ 1 ）为主要特点 [5] 。糖尿病患者组织器官长期处于高血糖状态会引发诸多并发症，导致心脑血管、肝、肾眼、足等部位的衰竭病变，且无法治愈[6-8] 。胰高血糖素样肽 1（GLP1）因与 GLP1 受体（GLP1R）结合后可刺激胰岛素分泌并抑制胰高血糖素分泌，已成为近些年糖尿病药物开发的重要靶点[9] 。已有的 GLPlR 激动剂类药物均属于大分子多肽类，不能口服给药，长期服用会产生诸多不良反应，且保存与运输条件要求严苛[10-11] 。因此需要寻找不良反应少且疗效长期稳定的 GLP1R 小分子激动剂药物。目前基于 GLPlR 为靶点构建的高通量 GLP1 激动剂筛选模型主要从受体与配体结合、检测胞内第二信使 cAMP、构建受体功能反应报告基因三个方面进行[12] 。但这些筛选模式假阳性高、筛选时间长、筛选效低，严重制约了 GLP1 类似物小分子药物的开发。因此建立筛选 GLPlR 激动剂模的研究变得尤为迫切。本文研究目的是建立一种新的 GLPlR 激动剂类药物筛选方法：构建稳定表达绿色荧光蛋白人 GLP1R 细胞模型 Rin-m5F/GLP1R-GFP并通过阳性药物百泌达、阴性药物格列本脲验证该模型应用于 GLPlR 激动剂类物筛选的效果。

　　细胞复苏后置于 25 cm 2 培养瓶中，在 37℃，5%CO 2 条件下培养，具体方法见参考文献[13] 。

　　胞悬液，均匀接种于 6 孔板中，设置细胞密度分别为2×10 5 、4×10 5 个·mL－ 1 ，CO2 培养箱过夜培养；

　　②根据转染试剂说明书上推荐的使用浓度制备转染溶液，质粒（μg）∶转染试剂（μL）分别为 1∶2、1∶3、1∶4。取 2.5 μg pCMV6-AC-GLP1R-GFP 质粒溶于 97 μL无血清 RMPI 1640 培养基中，轻轻来回混匀，室温静置5 min，使质粒与培养基充分混匀；再按照比例相应加入转染试剂，轻轻来回混匀，室温静置 40 min，使混合物充分混匀；

　　③ 弃掉 6 孔板中的培养基，用 PBS 洗2 遍，每孔加入 2 mL新鲜完全培养基；

　　④ 在转染组逐滴加入转染溶液，边加边晃动 6 孔板，使转染液与细胞培养基充分混匀。

　　⑤ 标记好空白组及对照组，将细胞放入 CO 2 细胞培养箱中，37℃、5%CO 2 培养24 h；

　　⑥倒置荧光显微镜下观察，随机选取视野并拍照。运用软件 Image-Pro-Plus 6.0 统计细胞数目，计算转染效率；

　　⑦ 去掉转染溶液，PBS 洗 2 遍，加入新鲜完全培养基恢复培养 2 d，备用。

　　① 取对数生长期 Rin-m5F细胞消化成单个的细胞悬液，均匀接种于 24 孔板中，过夜培养。

　　③ 按照步骤②中 G418 浓度梯度，每 2 日更换 1 次新鲜培养基（含 G418），连续培养观察 14 d。若孔内细胞大量死亡，则该孔 G418 减半筛选；若孔内细胞已全部死亡，则该孔停止加入 G418 溶液。每日在倒置显微镜下观察细胞死亡情况。

　　④ 将“2.2”项下恢复培养 2 d 后转染组的细胞，加入 1 mg·mL －1 G418 溶液培养 2 d，PBS 洗 2 遍，更换新鲜培养基继续培养，每日观察细胞生长情况。

　　② 加入 G418，筛选转染细胞。按“2.3”项下筛选得到的 G418 浓度，先选用使细胞大量死亡的浓度，然后更换小浓度 G418 继续筛选。

　　③ 每日在倒置荧光显微镜下观察，当转染组中未被转染的细胞全部被杀死，则停止 G418 筛选。

　　④PBS 洗 2 遍，更换新鲜培养基，37℃、5%CO 2 培养，至绿色荧光细胞出现单克隆团细胞。期间根据培养基颜色及细胞状态及时更换新鲜完全培养基。

　　⑤ 采用梯度稀释法筛选单克隆细胞株：将转染组中孔内的细胞用胰酶消化，弃掉胰酶，加入 1 mL新鲜完全培养基将细胞吹打成单个的细胞悬液。按照 10 倍稀释法，将细胞加入 96 孔板中依次进行稀释，直至孔内细胞浓度为 1 ～ 2 个每 100 μL。

　　⑥ 每日置于倒置荧光显微镜下观察，根据实际情况为细胞更换新鲜完全培养基。

　　⑦当 96 孔板内细胞密度达到 30%时，消化细胞移入 24孔内扩大培养。

　　⑧ 当 24 孔板内细胞密度达到 80%以上时，消化细胞移入 T-25 细胞培养瓶中扩大培养。

　　实验分为空白对照（完全培养基）、溶剂对照（培养基加入 1%PBS、1%酒精、1%DMSO）、阳性对照（GLP1R 靶点药剂，百泌达）、阴性对照（非 GLP1R靶点药剂，格列本脲）。不同浓度药物处理相同时间：浓度设置为 0.25、0.5、2.5、5 μg·mL－ 1 ，均处理 1 h。相同浓度药物处理不同时间：药物浓度为 0.25μg·mL－ 1 ，分别处理 10、20、40、120 min。

　　① 将无菌圆形玻片在酒精灯火焰上来回灼烧数次，冷却后平铺在 24 孔板内，每孔一片；

　　②取“2.4”项下获得的单克隆细胞 Rin-m5F/GLP1R-GFP接种于圆形玻片上，轻轻摇晃培养板，使细胞均匀分布在板内，过夜至细胞密度长至 85%以上；

　　⑤ 取洁净载玻片，滴加 20 μL防荧光淬灭粘片剂，用镊子轻轻夹起圆形玻片，轻轻倒扣在防荧光淬灭粘片剂上，防止气泡产生；

　　⑥ 将玻片置于暗室通风干燥过夜，制好的玻片于激光共聚焦荧光显微镜下观察并拍照。

　　采用 SPSS 17.0 软件进行统计学分析。数据以均数 ± 标准差（x±s）表示，组间采用单因素方差分析，各组均数都采用 LSD（Least-significant differencetest）检测，若 P ＜ 0.05 为差异有统计学意义。

　　细胞 Rin-m5F复苏时在显微镜下观察，细胞基本呈单个、圆形均匀分布在新鲜完全培养基内，细胞密度为 50%左右，培养基中无明显杂质。过夜培养后，细胞贴壁率为 90%以上，细胞轮廓清晰、多呈不规则形状分布，多呈岛状聚集铺开生长。经胰酶消化，显微镜下观察显示细胞逐渐变圆，细胞间开始出现间隙。吹打成单个以 1∶3 传代至 3 代时，细胞形态正常、生长速率恢复到最佳，每 2 ～ 3 日即可传代（见图 1）。

　　转染时在细胞接种量、质粒∶转染试剂 2 个方面进行优化，转染 24 h 后，倒置荧光显微镜下观察转染成功的细胞整个分布绿色荧光、荧光强度不一。拍照、统计转染效率分别见表 1。

　　Rin-m5F细胞孵育转染溶液 24 h、更换新鲜完全培养基恢复培养 24 h、1 mg·mL －1 浓度的 G418 筛选培养 2 d 后，倒置荧光显微镜下观察未被转染的细胞基本全部死亡。降低 G418 浓度至 100 μg·mL －1 ，每3 日更换 1 次新鲜完全培养基，成功转染的细胞扩大培养 12 d，按照 10 倍稀释法消化细胞接种于 96 孔板，选取荧光强、分布均匀的单克隆细胞并扩大培养，倒置荧光显微镜和激光共聚焦显微镜下观察、拍照，结果见图 3。